傷口愈合／細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)新方法－如何劃出筆直均一的劃痕

前言
     傷口愈合實(shí)驗(yàn)是體外研究細(xì)胞遷移的一個(gè)有用的實(shí)驗(yàn)。原理是人為的在鋪板的單層細(xì)胞中制造一個(gè)空白的無細(xì)胞的地帶，然后對(duì)這個(gè)無細(xì)胞地帶的邊緣的細(xì)胞進(jìn)行觀察；這些邊緣的細(xì)胞會(huì)開始進(jìn)行遷移活動(dòng)，并且zui終覆蓋整個(gè)無細(xì)胞的區(qū)域，重新互相接觸在一起。
 
 
傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法
     細(xì)胞在培養(yǎng)皿內(nèi)貼壁后，使用移液槍的槍頭在貼壁細(xì)胞的中間劃過，人為造成一道傷口（劃痕），之后定時(shí)測(cè)量劃痕的寬度，進(jìn)而得到傷口愈合的細(xì)胞遷移數(shù)據(jù)。
 
實(shí)驗(yàn)缺點(diǎn)：
1.手動(dòng)劃痕，不能保證每次劃痕的一致；
2.有時(shí)候在劃細(xì)胞的同時(shí)會(huì)刮壞一片細(xì)胞，對(duì)劃痕的邊緣的細(xì)胞造成機(jī)械損傷；
3.如果培養(yǎng)皿底部還有包被蛋白的話，槍頭劃過，很可能傷害到包被，進(jìn)而影響到細(xì)胞遷移，結(jié)果便很難判斷是哪個(gè)因素造成了決定性的影響。
4.定時(shí)測(cè)量劃痕的寬度，計(jì)算劃痕寬度隨時(shí)間推移的變化；在選取劃痕測(cè)量點(diǎn)時(shí)，不可避免地引入了主觀誤差（人為選取了遷移結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期的點(diǎn)）；
 
       綜上，傳統(tǒng)的傷口愈合方法總是重復(fù)性不佳，對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的闡述說服力不足。
       下面分享一種新方法，輕松得到筆直均一的劃痕！
 
實(shí)驗(yàn)核心
       使用傷口愈合插件制造筆直均一的劃痕（圖一）。

實(shí)驗(yàn)方法     
一.實(shí)驗(yàn)材料
1) 細(xì)胞:     MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)
2) 實(shí)驗(yàn)耗材:   ibidi 35 mm培養(yǎng)皿帶傷口愈合插件(ibidi, 81176) ibiTreat
3) 細(xì)胞培養(yǎng)基:  RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
4) 細(xì)胞消化試劑:  Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
5) 滅菌鑷子
6) 倒置顯微鏡，如果需要進(jìn)行連續(xù)的觀測(cè)搭配鏡載加熱孵育系統(tǒng)
 
一.實(shí)驗(yàn)步驟
1.鋪細(xì)胞（圖二）
為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在做實(shí)驗(yàn)之前進(jìn)行一次預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定需要使用的細(xì)胞懸液的密度。我們建議，將細(xì)胞懸液密度調(diào)整為24小時(shí)后正好可以長滿每個(gè)插件的小孔。
● 將ibidi傷口愈合培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶撕除。
● 準(zhǔn)備細(xì)胞懸液，調(diào)整懸液濃度為3*105 cells/ml，這樣24小時(shí)后，細(xì)胞能剛剛長滿單個(gè)小孔。
● 在ibidi細(xì)胞插件的每孔中加入70μl的細(xì)胞懸液。注意不要大力晃動(dòng)培養(yǎng)皿。以防止細(xì)胞不均勻。
● 在37。C培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。

圖二：A. 去除培養(yǎng)皿底部的保護(hù)膠帶。B.C.在ibidi傷口愈合插件中加入細(xì)胞。
 
1.形成“劃痕”
當(dāng)所有細(xì)胞都貼壁并且剛剛長滿的時(shí)候，就可以開始傷口愈合實(shí)驗(yàn)了。用鑷子將傷口愈合插件提出，之后加入新鮮的培養(yǎng)基，或者在培養(yǎng)基中加入刺激劑，然后觀察傷口愈合的情況。
● 24小時(shí)后對(duì)細(xì)胞前一天種的細(xì)胞做鏡檢。細(xì)胞要貼壁并且是剛剛長滿每個(gè)孔。長得過多移除插件時(shí)會(huì)帶走很多細(xì)胞，長得過少，傷口愈合的效果很差。
● 如圖三所示，小心的用鑷子夾住插件的一個(gè)角，將插件移除。 

圖三：用鑷子移除插件
● 移除插件后，要用顯微鏡檢查是否形成合格的“劃痕”（圖四）。
● 小心的清洗細(xì)胞，之后加入2ml培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。

圖四 筆直均一的劃痕
 
1.采集并分析圖像
一般傷口愈合實(shí)驗(yàn)都是采集一張“劃痕”的初始圖像，再在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)候采集一張“劃痕”愈合的圖像。我們建議可以在這個(gè)過程多做幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)，這樣可以觀測(cè)到細(xì)胞遷移隨時(shí)間的變化特征。
● 在顯微鏡下選取能同時(shí)看到“劃痕”和兩邊細(xì)胞的視野進(jìn)行成像，“劃痕”的方向在視野內(nèi)為水平的或者垂直的。
● MCF-7細(xì)胞每半小時(shí)采集一張圖片，一直持續(xù)到20小時(shí)。
● 采用ibidi傷口愈合分析軟件，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的覆蓋面積，做出曲線圖，可以看到在大約11個(gè)小時(shí)的時(shí)候，細(xì)胞基本就已經(jīng)長滿了，接下來幾個(gè)小時(shí)細(xì)胞覆蓋面積都不會(huì)發(fā)生變化（圖五）。

圖五(a)  顯微鏡下觀察細(xì)胞覆蓋面積的變化

圖五(b)  細(xì)胞覆蓋面積的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
 
 
實(shí)驗(yàn)總結(jié)對(duì)比
1.本實(shí)驗(yàn)方法能得到重復(fù)性更好的劃痕（圖六）；

圖六 通過計(jì)算劃痕的面積可以看出，在多次實(shí)驗(yàn)中，槍頭劃痕（左圖）
制造的劃痕面積數(shù)據(jù)波動(dòng)大，重復(fù)性差；ibidi傷口愈合插件（右圖）制造的劃痕面積數(shù)據(jù)統(tǒng)一，重復(fù)性良好
 
 
2.不會(huì)刮壞細(xì)胞，也不會(huì)造成劃痕的邊緣的細(xì)胞有機(jī)械損傷；
 
3.不會(huì)傷害到培養(yǎng)皿底部的包被蛋白；

圖一：左圖表示槍頭劃過后，底部包被蛋白被劃傷，細(xì)胞遷移結(jié)果受到底部不均一的影響。右圖ibidi插件移除后底部的包被蛋白沒有被破壞。
 
4.通過計(jì)算細(xì)胞覆蓋面積得出細(xì)胞遷移結(jié)果，避免人為選取測(cè)量點(diǎn)，使數(shù)據(jù)更客觀。1天內(nèi)就能得到測(cè)量結(jié)果，實(shí)驗(yàn)分析更快更準(zhǔn)確。